RAPD-原理 

RAPD擴(kuò)增圖
RAPD，即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)，是由美國科學(xué)家Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的，又稱任意引物PCR。它的應(yīng)用是基于這樣的一個(gè)推理：對于同一模板DNA，用同一引物擴(kuò)增既可能得到相同的帶譜（模板基因組間可能具有同源性），也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶就可作為該模板的分子標(biāo)記。事實(shí)上，不同基因組DNA總是一定差異的，所以用就可以進(jìn)行分子標(biāo)記研究。理論上講，在一定的擴(kuò)增條件下，擴(kuò)增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對特定的引物，復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)也越多。
90年代前期技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用，幾乎所有的作物都有這方面的研究報(bào)告。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定的缺陷，并對此作了一些探索。

-特點(diǎn) 
技術(shù)目前運(yùn)用相當(dāng)廣泛， 幾乎滲透于整個(gè)基因組研究的各個(gè)方面， 這與它所具有的眾多優(yōu)勢是分不開的。

① 無需專門設(shè)計(jì) 擴(kuò)增反應(yīng)引物，也無須預(yù)先知道被研究生物基因組的核苷酸序列，引物可隨機(jī)合成和隨機(jī)選定，長度一般為9- 10 個(gè)核苷酸； 
② 每個(gè) 反應(yīng)中，僅加單個(gè)引物，就可通過引物和模板DNA 隨機(jī)配對實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，擴(kuò)增無特異性； 
③ 退火溫度低，一般為36℃，這樣的溫度能保證核苷酸引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合，同時(shí)允許適當(dāng)?shù)腻e(cuò)誤配對，以擴(kuò)大引物在基因組DNA中配對的隨機(jī)性，使 有較高的檢出率；
④ 技術(shù)簡便易行、省時(shí)省力，不需要RFLP 分析的預(yù)備性工作：如克隆的制備、同位素標(biāo)記、Southern 印記反應(yīng)及分子雜交。 易于程序化，利用一套隨機(jī)引物可得到大量的分子標(biāo)記，并可借助于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行分析； 
⑤ 分析所需的DNA 樣品量極少，僅為RFLP 的1ö 1000 - 1ö 200，這對于生物早期取樣鑒定或在DNA 受限制的情況下是十分有利的。

-試驗(yàn)條件 

-原理
1. 藥品試劑
模板DNA（10～100ng）
寡核苷酸引物（20mmol/L貯存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司購買，也可以自己合成）

0.2 mmol/L dNTPs（必須使用高質(zhì)量的dNTPs，這一點(diǎn)非常重要。dNTPs經(jīng)反復(fù)化凍后會發(fā)生降解，因此應(yīng)分成小份保存。應(yīng)注意混合物中四種dNTP的量要相等）

Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）

10×PCR緩沖液（500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris•HCl, pH 8.3）

礦物油

電泳所需試劑

2. 儀器設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀

電泳裝置

微量離心機(jī)

微量移液器（1～20ml和20～200ml）

0.5 ml Eppendorf管

-操作程序 
（1）在冰里向無菌的Eppendorf管中加入以下反應(yīng)物：

  水                 14.75 ml      
  10×緩沖液             2 ml 
  10×dNTPs              2 ml 
  引物（20 mmol/L）    0.2 ml 
  Taq DNA聚合酶   
  終體積    
  DNA（10～100ng）       1 ml 
  石蠟油                20 ml 

（2）93℃反應(yīng)2 min后開始如下循環(huán)：

 93℃變性反應(yīng)1min
 56℃退火反應(yīng)1min
 72℃延伸反應(yīng)1.5min
 經(jīng)過45個(gè)循環(huán)后，zui后一個(gè)循環(huán)72℃增加5min，循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存。

（3）20ml反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色檢測擴(kuò)增的情況。

-試驗(yàn)注意及解決方法    
（1）擴(kuò)增偏差或無擴(kuò)增。

――在部分或全部管中缺少一個(gè)組分。重復(fù)少量幾個(gè)反應(yīng)以確定所有的PCR組分是否都已加入。
――PCR抑制物可能與DNA一起純化，改變DNA的濃度。
――在DNA分離中加入一個(gè)清洗步驟（如苯酚抽提）。
――稀釋新的DNA溶液。
――引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物濃度。
――延長退火時(shí)間（在PCR程序中的第二部分），或降低升溫轉(zhuǎn)換步驟之間的速率。
――提高每個(gè)反應(yīng)中的Taq聚合酶的濃度。
――補(bǔ)加新的組分，該滅菌的都高壓滅菌。

（2）擴(kuò)增結(jié)果差，條帶模糊或難以辨認(rèn)。

――更換Taq聚合酶緩沖液。
――檢查引物（使用另外一個(gè)引物，或者將引物末端標(biāo)記，在16% 6mol/L尿素聚丙烯酰胺膠上電泳檢測）。
――檢查Taq聚合酶活性（與不同批量的酶作比較）。
――改變DNA濃度。

（3）高相對分子質(zhì)量產(chǎn)物彌散狀分布>4kb。

――降低DNA濃度。
――降低Taq聚合酶濃度。
――減少凝膠上樣量。
――可能是由于循環(huán)數(shù)過多的結(jié)果（Bell和Demarini 1991），減少循環(huán)數(shù)。
――確認(rèn)是否使用正確的緩沖液（不是水?。┲苽淠z。
――在較低的電壓下電泳。

（4）在對照和所有檢測樣品中均為一條很強(qiáng)的單一帶。

――確認(rèn)引物序列不是回文結(jié)構(gòu)。這可能是引物多聚體造成的結(jié)果。使用不同的引物。

（5）帶譜不可重復(fù)。

――DNA過多或過少。把基因組DNA濃度控制在10～100ng范圍之內(nèi)，DNA量太少時(shí)，“真正”靶序列與引物的結(jié)合效率低，因此引物擴(kuò)增會產(chǎn)生假的條帶，這就稱為引物偽跡；DNA量太多會導(dǎo)致錯(cuò)誤配對（指引物與基因組DNA的配對）。每個(gè)樣品進(jìn)行兩個(gè)不同DNA濃度的反應(yīng)。
――只考慮主要條帶。

（6）染色后凝膠背景太強(qiáng)影響分辨率。

――減少染色時(shí)間。
――凝膠脫色時(shí)間延長。
――PCR反應(yīng)中DNA含量或Taq聚合酶過多。

（7）低相對分子質(zhì)量產(chǎn)物分離不充分。

――在更高濃度的瓊脂糖凝膠、專業(yè)純凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上分離產(chǎn)物。

-技術(shù)問題及對策 
技術(shù)是由多種成分參加的生化反應(yīng)，反應(yīng)中各種成分均為微量，盡管其反應(yīng)靈敏度高，但是影響因素較多，會出現(xiàn)重復(fù)性差等一些問題。為了得到較穩(wěn)定的結(jié)果，各種反應(yīng)參數(shù)必須事先優(yōu)化選擇，操作中每一步都必須小心謹(jǐn)慎，以防止出現(xiàn)差錯(cuò)。

1 溫度

一般反應(yīng)條件是：變性92－95℃，常用94℃，30－60s；延伸72℃，60－120s；退火35－37℃，30－60s。變性和延伸溫度一般沒有太大變化，而退火溫度影響較大。退火溫度低，引物和模板結(jié)合特異性較差，出現(xiàn)的條帶可能增多；退火溫度高，引物和模板結(jié)合特異性增加。有人提出，在尋找基因差異為目的的實(shí)驗(yàn)中，退火采用33－34℃效果更好。在優(yōu)化方案中，退火溫度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的＂帶＂。溫度的梯度率也是十分重要的，特別是退火與延伸之間的梯度尤為重要。各種儀器的控溫、升降溫性能均有差別，一些儀器（如一些舊型號的儀器）在到達(dá)特定的溫度前就開始計(jì)時(shí)，一些PCR儀顯示的溫度與實(shí)際溫度會有差異。這些在設(shè)計(jì)程序和結(jié)果分析時(shí)有必要考慮，所以注明所用儀器的生產(chǎn)廠家、品牌、規(guī)格，就顯得很有必要，對于同一批實(shí)驗(yàn)，注意控制在同樣的溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果才有可比性。

2 反應(yīng)物的影響

PCR擴(kuò)增受多種成分的制約，產(chǎn)物僅在部分循環(huán)中呈指數(shù)式（2）增長，逐漸將達(dá)到一個(gè)平臺期，模板是關(guān)鍵制約因素之一，產(chǎn)物取決于此，實(shí)驗(yàn)中非常的模板濃度是十分關(guān)鍵的一個(gè)步驟。濃度過低，分子碰撞機(jī)率低，偶然性大，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定；濃度過高，會增加非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物。更重要的是，若循環(huán)數(shù)控制不好，引物過早消耗完，后面循環(huán)中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3端會和原模板及每一次循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物退火，造成不等長度的延伸。因此，如果原模板濃度過高，非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物就足以形成背景，這是高濃度模板造成彌散型產(chǎn)物的原因。相對而言，模板純度影響不大，即反應(yīng)液中蛋白質(zhì)、多糖、RNA等大分子物質(zhì)影響不大。理想的模板和引物濃度能產(chǎn)生多態(tài)性豐富、強(qiáng)弱帶分明的圖譜。引物3端的重要性似乎更大。此外，Mg＋2濃度也影響反應(yīng)的參數(shù)包括產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成，人們在各自的實(shí)驗(yàn)中得出不同的結(jié)論，大約在1.5－4mmol/L范圍內(nèi)?？傊?，各種反應(yīng)物的濃度應(yīng)事先進(jìn)行篩選優(yōu)化。

3 污染問題

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)空白對照，因?yàn)橐?、各種緩沖液和雙蒸水都會造成污染。而且Taq酶也可能出現(xiàn)污染，給分析帶來困難，所以必須設(shè)置對照以排除系統(tǒng)誤差。并且，酶也盡可能優(yōu)化。

4 擴(kuò)增條帶的取舍

重復(fù)性問題 為了克服重復(fù)性差的問題，應(yīng)設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)。作為DNA多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的條帶是應(yīng)該可重復(fù)的，重復(fù)性好是zui重要的取舍指標(biāo)，而帶的強(qiáng)弱不應(yīng)該作為取舍的指標(biāo)。有學(xué)者認(rèn)為帶的強(qiáng)弱與其在基因組中的拷貝數(shù)有關(guān)。但據(jù)Thormann對十字花科植物分析，產(chǎn)物的強(qiáng)弱與該產(chǎn)物在基因組中的拷貝數(shù)無直接關(guān)系，而與引物及模板的同源性程度有關(guān)。分析一個(gè)位點(diǎn)時(shí)，要作全面分析，若某一個(gè)體的全部帶均弱，其模板可能有問題（濃度、分子量）；若某一個(gè)體的大部分帶與其它個(gè)體強(qiáng)度一致，僅有一條或少數(shù)幾條帶弱，可能存在拷貝數(shù)差異。重復(fù)性不好的弱帶（無規(guī)律出現(xiàn)的帶）可能由非專一性擴(kuò)增、產(chǎn)物間退火或其它人為因素造成，不能記錄。

異源雙鏈問題 Ayliffe研究亞麻銹病菌時(shí)發(fā)現(xiàn)F1代中出現(xiàn)的一條帶在親本中沒有出現(xiàn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這一條帶是由2個(gè)等位基因組成的異源雙鏈形成的，這2個(gè)等位基因除中間插入的38bp的序列外，其余序列相同。這種條帶可以在后代中遺傳，在該研究中這種條帶大約占0.16％。在蜜蜂的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的問題，這種條帶可以用單鏈核酸酶將其消除。也可以將電泳溫度提高到60℃以上，使異源雙鏈變性，以消除其影響。

非孟德爾遺傳的條帶 Heun等分析認(rèn)為，在顯示多態(tài)性的非模糊條帶中有92.5％的表現(xiàn)為孟德爾顯性遺傳，其余的條帶不符合孟德爾遺傳，分析認(rèn)為可能由不同的序列組成。一般實(shí)驗(yàn)中大多采用符合孟德爾遺傳的條帶進(jìn)行分析。在連鎖圖譜分析中，基因型錯(cuò)誤可以部分消除，即在F1代或1：1混合物中沒有出現(xiàn)的條帶，在其父母本中應(yīng)盡可能去掉。

同一條帶的同源性問題 Thormann將產(chǎn)物標(biāo)記作探針，雜交結(jié)果表明，與探針片斷遷移率一致的帶有時(shí)并不同源，這種情況僅發(fā)生在種間。并比較了RFLP和標(biāo)記在種內(nèi)和種間得出的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RFLP和標(biāo)記在種內(nèi)水平的結(jié)果*吻合，但在種以上等級的結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，這說明在電泳結(jié)果的同一個(gè)帶中，有可能存在序列不同但分子量相同的幾條帶，無法檢測。這種可能在種內(nèi)較少發(fā)生，而這種間可能性較大，Castagna用RFLP和比較研究也得出了相同的結(jié)論。

5 電泳分辨率問題

電泳時(shí)，基因組不同位置的擴(kuò)增產(chǎn)物共同移動的可能性是有的，即不同分子量的擴(kuò)增產(chǎn)物可能在電泳時(shí)沒有分開而形成一條帶，凝膠分離系統(tǒng)和基因組的親緣關(guān)系有可能提高這種概率。一般而言，聚丙烯酰胺和銀染的分辨效果比瓊脂糖和溴化乙銨要高，用較長（可達(dá)到20cm）或濃度更高（2%）的瓊脂糖凝膠有助于提高分辨率。當(dāng)然，隨著分辨率和靈敏度的提高，更可能出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)誤差。所以有人評述：zui保險(xiǎn)而簡單的方法是用瓊脂糖電脈分離而且只注意那些無疑而重發(fā)性高的帶。但是，聚丙烯酰胺和銀染所揭示的高信息量的多態(tài)性無疑可加快分子標(biāo)記的鑒定過程。

6 顯性標(biāo)記問題

標(biāo)記來自于模板DNA的復(fù)制，經(jīng)過30一40次循環(huán)，擴(kuò)增條帶數(shù)量理論上可達(dá)2。原模板中擴(kuò)增位點(diǎn)是純合還是雜合已無法判斷，因?yàn)榧兒衔稽c(diǎn)的擴(kuò)增條帶只相當(dāng)于雜合位點(diǎn)的2倍，電泳時(shí)無法檢測到其差別。雜交中。如果親本一方為純合體，F(xiàn)1代就可以全部表現(xiàn)出該條帶；如為雜合體，該條帶在F1中應(yīng)為l：l分離，即一半后代有該條帶，而另一半則沒有。當(dāng)然來自于多拷貝區(qū)的條帶分析更為復(fù)雜。

-應(yīng)用問題及策略
1 遺傳圖譜構(gòu)建的問題

分析樣品
是一種顯性標(biāo)記，符合孟德爾遺傳定律，不能區(qū)分雜合型和純合型，因此在遺傳分析及遺傳圖譜的構(gòu)建等一些方面受到限制。目前，在實(shí)踐中，主要利用了以下2種方法。
①利用單倍體 利用胚乳進(jìn)行分析，可以克服構(gòu)建遺傳圖譜中這些困難。因?yàn)獒樔~樹的胚乳是單倍體，記錄了雜合的母本染色體組在減數(shù)分裂過程中的遺傳事件，不存在雜合型，進(jìn)行遺傳分析時(shí)，與共顯性標(biāo)記具有同樣的遺傳行為，是天然的優(yōu)良作圖材料。現(xiàn)在已進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建的有濕地松、歐洲赤松、火炬松、楊樹、日本柳杉和桉樹。但是由于缺乏細(xì)胞遺傳學(xué)的研究，暫時(shí)還不能確定連鎖群和染色體之間的對應(yīng)關(guān)系。

②將條帶作為單劑量標(biāo)記，單劑量標(biāo)記（Single-dose markers）是從兩物種和其雜交產(chǎn)生F1代的分子標(biāo)記中選擇的。選擇構(gòu)建圖譜用的標(biāo)記有2個(gè)原則：A、它們必須在一個(gè)親本中存在而在另一個(gè)親本中不存在；B、它們在后代中必須以l：1分離。這種方法相當(dāng)于一個(gè)雜合體和一個(gè)隱性純合體的測交，稱為雙向假測交（Two-way pseudo-testcross）。在多倍體植物中，不論基因組是如何組成的（異源多倍體或同源多倍體），也不論材料的多倍性水平如何，單劑量的標(biāo)記都相當(dāng)于簡單的等位基因（同源多倍體）或相當(dāng)于二倍體基因座上的雜合等位基因（異源多倍體）。因此根據(jù)這些單劑量標(biāo)記的連鎖情況可以構(gòu)建分子圖譜。條帶作為單劑量標(biāo)記使那些基因組DNA含zui大，世代周期長的喬木和多倍體植物的遺傳圖譜研究走出了幾乎停滯的狀態(tài)。Grattapagalia利用這種策略首先構(gòu)建了巨桉和尾葉桉的分子連鎖圖譜。Conner利用這種策略構(gòu)建了3個(gè)蘋果品種的分子圖譜。Mudge利用甘蔗及雜交后代的條帶作為單劑量標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析構(gòu)建了甜根子草的51個(gè)連鎖群，并分析了其染色體組的數(shù)目。雖然這些連鎖圖譜是個(gè)體特異性的，但可以為數(shù)量性狀定位提供框架結(jié)構(gòu)，為標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

2 系統(tǒng)學(xué)研究中的問題

系統(tǒng)學(xué)是研究zui為迅速的領(lǐng)域，許多作物都用作過親緣關(guān)系分析，大部分結(jié)果和形態(tài)分類結(jié)果相類似，僅有少數(shù)例外。但是近年來，有人對其結(jié)果的可靠性提出不同的看法，主要有以下幾點(diǎn)：

①由于引物的競爭性等，基因組的位點(diǎn)有時(shí)不能全部檢出，造成假象上的差異。根據(jù)這種情況，可以認(rèn)為，可以應(yīng)用于種間乃至近緣屬之間關(guān)系的研究，但有一定的局限性。因不同種度的擴(kuò)增產(chǎn)物難以作同源性分析，只能作表征分析，從而只能從相似性或遺傳距離上去分析親緣關(guān)系。其結(jié)果可能與真實(shí)的系統(tǒng)關(guān)系相左。

②因在種間或?qū)匍g的變異水平很高，取樣代表性是一個(gè)較大的問題，即利用某一個(gè)體代表一個(gè)種或用一個(gè)種代表一個(gè)屬都可能造成結(jié)果的偏差。因而，能找到群體特異或種特異性的條帶。

③在表征分析中另一個(gè)值得注意的問題是一些產(chǎn)物的出現(xiàn)存在相關(guān)關(guān)系，即一個(gè)位點(diǎn)與另一個(gè)位點(diǎn)相連鎖。若將這個(gè)差異單獨(dú)計(jì)算，相當(dāng)于對某一性狀極度加權(quán)。

④在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析中，因?yàn)闂l帶具有顯性的遺傳特征，多態(tài)性信息量較低。如果其符合二歧分枝樹的假定，就可以對變化的性狀予以加權(quán)，并進(jìn)行分析。但是許多植物的核基因組是有性的二倍體，而且它們的進(jìn)化歷史是網(wǎng)狀分枝樹，不便于分析。通常認(rèn)為葉綠體、線粒體和有些細(xì)菌及真菌的病原體符合二歧分枝樹的假定。但由于其基因組較小，沒有重組，它們的信息量只相當(dāng)于核基因組中具有多個(gè)等位基因的一個(gè)同工酶座位，這樣估算的基因多樣性值的標(biāo)準(zhǔn)差理論上會比有多個(gè)核基因蛋白座位得出的大。其非編碼區(qū)在一些動物類群中的進(jìn)化速度很快，因此做種上水平研究時(shí)將會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，但種下水平影響較小。

⑤和農(nóng)藝性狀的系統(tǒng)分析比較說明，二者相差不大，沒有出現(xiàn)相反的情況。而且比農(nóng)藝性狀提供了更多的遺傳信息。

總之，用作系統(tǒng)分析應(yīng)結(jié)合其它方法，結(jié)果才更有說服力。

3 標(biāo)記、定位目的基因

標(biāo)記、定位目的基因是相對較為緩慢的一個(gè)領(lǐng)域，這是因?yàn)闃?biāo)記探測的是整個(gè)基因組的變化，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，要和基因位點(diǎn)起來有一定的困難。一般的變異群體性狀的變化涉及到基因組內(nèi)較大的范圍（微效多基因），不可能全部檢出。而且檢出的多態(tài)性又不一定是性狀變異的標(biāo)志（可能擴(kuò)增于非編碼區(qū)）。另一困難是擴(kuò)增的特異性片段有些為重復(fù)序列，轉(zhuǎn)化為RFLP探針有一定困難。據(jù)Grattapaglia用48個(gè)片段所作的雜交實(shí)驗(yàn)表明，有53%來自于低拷貝區(qū)（1000）。這只有通過篩選出與單拷貝區(qū)連鎖的標(biāo)記予以解決。如果標(biāo)記和基因位點(diǎn)或性狀不能起來，其實(shí)用價(jià)值就會大大降低。為此人們作了以下探索。

①利用易位系、回復(fù)突變系、等位基因系、近交重組系等特殊材料 從理論上講，除目的基因及鄰近區(qū)域外，其它部分*一致。如果檢測出多態(tài)性，差異必定在目的基因及鄰近區(qū)中，也就是說標(biāo)記在這個(gè)范圍內(nèi)與目的基因連鎖。但是要獲得這些材料比較困難，例如等位基因系需要回交20代，時(shí)間太長。分析中一般用近等位基因系NILs（Near isogenic lines），回交6代以上即可?；亟?代時(shí)，供體DNA的比例為l/128，用找到的與目的基因連鎖的標(biāo)記與目的基因在距離上還相當(dāng)遠(yuǎn)。

②集團(tuán)分離法（BSA）對不存在上述特殊生物模型的群體，可采用這種方法。即利用F2分離群體為材料，根據(jù)目的基因的表型把F2群體分為2群（例如抗病的和不抗的），每一群中將各個(gè)體DNA等量混合，這樣形成2個(gè)DNA混合池。在每個(gè)基因池中，不管群體性狀如何，在目的基因的表型上都是一致的，2個(gè)群體之間，目的基因的表型都是相反的。因此，在2個(gè)群體之間*不同、在每個(gè)群體之內(nèi)各個(gè)體間又是*相同的擴(kuò)增產(chǎn)物即可認(rèn)為是與目的基因連鎖的標(biāo)記。這種方法相當(dāng)于把分析材料作為近等位基因系。

在找到合適的分子標(biāo)記后，既可直接用于輔助選擇育種（Molecule-marker assisted selection，MAS），也可通過對特異片段的分離和兩端測序?qū)⒅D(zhuǎn)換為序列標(biāo)志位點(diǎn)（Sequence-tagged sites，STS）。從這個(gè)分子標(biāo)記出發(fā)找到目的基因需經(jīng)過幾個(gè)步驟：A、用稀有切點(diǎn)內(nèi)切酶將基因組DNA切成大片斷DNA；B、用脈沖電泳分離大片斷DNA；C、將大片斷DNA克隆到Y(jié)AC（Yeast artificial chromosome）中，建立YAC文庫；D、以顯示多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物為探針從YAC文庫中調(diào)出含有該標(biāo)記和與其連鎖的目的基因的大片斷DNA；E、以該標(biāo)記為起點(diǎn)向目的基因進(jìn)行染色體滑步或跳躍，以找到目的基因。Michelmore首先利用這種方法找到了萵苣抗性基因的標(biāo)記，Koller等利用這種方法找到與蘋果瘡痂病抗性基因有關(guān)的分子標(biāo)記。

③利用一套缺體一四體系或雙端體系，以獲得與目的基因連鎖的標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，然后進(jìn)行原位雜交，確定特異性帶在染色體上的位置。

這些工作在一些基礎(chǔ)研究較多的領(lǐng)域或與人類關(guān)系較為密切的物種中進(jìn)展較為迅速，比如小麥、水稻找到的分子標(biāo)記已有許多。但林木等多年生植物研究進(jìn)展稍遲滯，關(guān)鍵是缺乏合適的群體。

4 純度和外源基因檢驗(yàn)問題

雖然由于條帶的靈敏和重復(fù)性等問題，純度檢驗(yàn)研究還只停留在實(shí)驗(yàn)階段。但已有的對大麥、玉米、大豆、棉花、小麥、水稻的實(shí)驗(yàn)表明，技術(shù)是鑒定品種的有效方法。相信其在純度檢驗(yàn)和保護(hù)方面會取得較為廣泛的應(yīng)用。

- 技術(shù)與PCR 技術(shù)區(qū)別 編輯本段回目錄
技術(shù)源于PCR 技術(shù)，但又不同于PCR 技術(shù)，差別主要體現(xiàn)在隨機(jī)擴(kuò)增引物上。首先，隨機(jī)擴(kuò)增引物是單個(gè)加入，而不是成對（正、反向引物） 加入， 其次， 隨機(jī)引物短，一般 技術(shù)采用的引物含10 個(gè)堿基，由于隨機(jī)引物較短，與常規(guī)PCR 相比， 退火溫度較低，一般為35 - 45 ℃。
技術(shù)以一系列隨機(jī)引物對基因組進(jìn)行檢測，因而能檢測多個(gè)基因位點(diǎn)，覆蓋率比較大，并且引物越多，覆蓋面越廣，遺傳信息也隨之增加，因此 多態(tài)信息含量（ PIC） 值波動較大，在0. 2 - 0. 9 之間。另外， 指紋呈孟德爾式顯性遺傳。

-中藥材鑒定中的作用 
1. 植物藥材相近種類的鑒定

邵鵬柱等在1994 年報(bào)道了對中藥材人參與西洋參采用Ap2PCR 標(biāo)記進(jìn)行鑒別，他們采用20 個(gè)堿基的Galk ，Seq2 ，24 個(gè)堿基的MB forward ，MB reverse 和27 個(gè)堿基的OTCSbackward 作引物成功地利用AP2PCR 指紋圖譜技術(shù)鑒定出人參和西洋參。1995 年分離人參屬三種植物人參、西洋參、三七（P. notoginseng） 和四種偽品包括桔梗、紫茉莉、櫨蘭、商陸的基因組DNA ，分別采用10 個(gè)堿基的OPC25 和OPC220 作引物，用 標(biāo)記可以明顯地區(qū)別，說明DNA 分子也能區(qū)別人參屬三個(gè)品種和人參及其偽品。中國南方部分省區(qū)有多種菊科不同屬的植物如地膽草、一點(diǎn)紅、苦荬菜、毛大子草、山萵苣、苦苣菜以“土公英”混作蒲公英使用。曹暉等利用Ap2PCR 和分子標(biāo)記技術(shù)對蒲公英及六種土公英混淆品進(jìn)行了DNA 指紋鑒別研究，結(jié)果顯示它們的DNA 指紋圖譜存在明顯差異，利用這種差異可以從分子水平上鑒別蒲公英及其混淆品。Kohjyouma M 等采用CTAB 法提取菊科蒼術(shù)屬五種植物茅蒼術(shù)、北蒼術(shù)、單葉蒼術(shù)、關(guān)蒼術(shù)和白術(shù)等新鮮葉片組織的基因組DNA ，利用 技術(shù)獲得了清晰的多態(tài)性DNA 指紋圖譜，能明顯地區(qū)分蒼術(shù)的幾個(gè)品種，發(fā)現(xiàn)在基因水平上單葉蒼術(shù)與茅蒼術(shù)十分接近，而與白術(shù)和關(guān)蒼術(shù)相距較遠(yuǎn)，后兩者與北蒼術(shù)又相近似。這一結(jié)果與PFL P （ Restriction fragmentlength polymorphism） 方法得到的結(jié)果相近。說明 能有效地鑒別蒼術(shù)屬植物。

2. 植物藥材基原的鑒定

Yamazaki M 等采用酸性緩沖液提取法分離了4 種菊科甘草屬植物光果甘草、甘草、刺毛甘草和刺果甘草的基因組DNA ，通過對 指紋圖譜分析，表明光果甘草與甘草遺傳關(guān)系非常接近，刺毛甘草和刺果甘草的遺傳關(guān)系相距較遠(yuǎn)，這種結(jié)果與RFL P 所得結(jié)果類似，也與植物分類學(xué)研究吻合。他們進(jìn)一步對4 種商品甘草藥材（新疆甘草、西北甘草、西伯利亞甘草、阿富汗甘草） 采用 方法作遺傳距離估算，來對其進(jìn)行基原鑒別，逐步證實(shí)了阿富汗甘草來源于光果甘草、西伯利亞甘草來源于甘草、新疆甘草和西北甘草來源于刺果甘草。曹暉等以CTAB 微量提取法分離菊科植物地膽草、白花地膽草和假地膽草以及四種商品苦地膽藥材的基因組DNA ，采用長引MBforward（24 個(gè)堿基） ，GalK（20 個(gè)堿基） 進(jìn)行AP2PCR 擴(kuò)增和用OPC26 （10 個(gè)堿基） 的短引物進(jìn)行 擴(kuò)增，獲得清晰可靠的DNA 指紋圖譜，根據(jù)DNA帶型差異鑒別出地膽草及其混淆品。同時(shí)通過對DNA 指紋圖譜的相似度指數(shù)值計(jì)算， 證實(shí)四種商品藥材苦地膽的基原為菊科植物地膽草。                                                                                                                                            

3. 復(fù)方制劑、粉劑中藥材品種的鑒定

中藥材復(fù)方制劑、粉劑等由于其中的各種生藥外觀性狀*遭到破壞，要了解某味藥是否存在，用傳統(tǒng)的鑒定方法有時(shí)難以奏效。但是使用 技術(shù)時(shí)，從理論上來講，如果只要能制備出該種藥材的高度特異性的寡核酸引物，即可達(dá)到鑒定的目的。Ozeki 等采用GTC（異硫氰酸胍） 微量提取法分離人參屬三種植物人參、西洋參和竹節(jié)參以及兩種人參制劑高麗紅參泡茶OTANECHAN（日本的一種人參組織培養(yǎng)物制成的茶） 的基因組DNA ，通過 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參的根毛組織和干燥藥材產(chǎn)生相同的 指紋圖形，人參、西洋參和竹節(jié)參之間采用不同的引物產(chǎn)生不同的 指紋圖；高麗紅參泡茶中幾乎沒有DNA 片段擴(kuò)增（ 其提取物無DNA 模板之故） ， 但從OTANECHAN 中擴(kuò)增到了與人參愈傷組織相同 指紋的DNA 片段。這表明了 技術(shù)應(yīng)用于中藥傳統(tǒng)制劑中組分鑒別的可能性。黃璐琦等對來源于已于13 個(gè)種3 個(gè)變種的天花粉及其類似品共26 份樣品，用8 個(gè)擴(kuò)增多態(tài)性好的引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，得到清晰、穩(wěn)定的條帶83 條，然后采取聚類分析的方法。結(jié)果表明全部樣品可被有效地分為三大類：*類是大宗商品和小宗商品，第二類是天花粉藥材商品中極易混淆的湖北栝樓根和紅花栝樓根，第三類全部是混淆品和地區(qū)習(xí)慣用藥。對不同植物來源的天花粉，尤其是對來自不同組或組上水平的天花粉采 技術(shù)能夠很好地把它們區(qū)別開來，其結(jié)果與物種間的親緣關(guān)系基本一致。這為解決粉末及破碎藥材的鑒定提供了新的方法。

4.  動物藥材的鑒定

目前這方面的文獻(xiàn)報(bào)道比較少。王義權(quán)等成功地將 技術(shù)應(yīng)用于六種蛇類的基因組DNA的多態(tài)性檢測，在20 個(gè)引物中找出16 個(gè)引物產(chǎn)生了253 個(gè)擴(kuò)增片段，準(zhǔn)確地區(qū)別了游蛇科5 個(gè)種和蝰蛇科1 個(gè)種，片段分布和片段共享度聚類分析所得的游蛇科5 種蛇之間的親緣關(guān)系與染色體、顱骨和陰莖研究的結(jié)果基本一致。顯示DNA 分子標(biāo)記技術(shù)可以成為一種準(zhǔn)確鑒別蛇類藥材的新方法， 同樣適合于動物中藥材的鑒定。

5. 藥材的野生類型與栽培品種的鑒定

由于生態(tài)環(huán)境的改變和人們生產(chǎn)活動的影響，中藥材遺傳特性及其生藥品質(zhì)在一定程度上產(chǎn)生了變化，產(chǎn)地和栽培也對生藥品質(zhì)和藥性產(chǎn)生巨大影響。在人類回歸自然呼聲日益高漲的今天，人們普遍認(rèn)為野生品比栽培品要好。同時(shí)，由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，以栽培品冒充野生品的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，給臨床造成混亂。因野生品和栽培品來自同一個(gè)物種，植物形態(tài)、藥材性狀、化學(xué)成分、生物活性等往往無明顯差異，這就需要尋找一種有效的方法進(jìn)行鑒別， 等分子標(biāo)記的產(chǎn)生為這種鑒定提供了良好的應(yīng)用前景。馬小軍等利用、A FL P 標(biāo)記對人參、圓參與山參品種的研究中發(fā)現(xiàn)，、AFLP 標(biāo)記可以用于野生與栽培品種的鑒別，其長脖類型更接近野生人參。

6. 道地藥材鑒定

道地藥材是人們在長期的臨床實(shí)踐中，經(jīng)臨床總結(jié)作為評價(jià)藥材質(zhì)量的綜合標(biāo)準(zhǔn)。它是一種長期進(jìn)化和生態(tài)適應(yīng)過程中，某一物種的變種、生態(tài)型、品種或居群適應(yīng)于特定的生態(tài)地理環(huán)境條件所形成的優(yōu)良種質(zhì)資源。道地藥材的研究，包括其形成與鑒定，過去主要集中于化學(xué)、藥理研究，從DNA 標(biāo)記水平的報(bào)道很少。胡珊梅等用技術(shù)探討澤瀉道地藥材與非道地藥材之間遺傳變異的大小， 并建立了道地藥材的品質(zhì)鑒定方法，為道地藥材研究提供了有益的啟示。可以預(yù)見，借助分子標(biāo)記，對道地藥材的快速、準(zhǔn)確鑒定，無疑會給我們提供新思維、新視野。

-分子生藥學(xué)中的應(yīng)用 
目前，標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于分子生藥學(xué)各方面：

①生物多樣性：隨著植物藥研究的不斷深入，可持續(xù)開發(fā)利用藥用植物資源的問題越來越受到重視。應(yīng)用技術(shù)進(jìn)行藥用植物生物多樣性研究，可以在遺傳多樣性水平上了解天然產(chǎn)物多樣性與物種、生態(tài)及地理分布的關(guān)系，挖掘潛在的藥物資源，為開發(fā)新藥尋找途徑。方法可以檢測物種的遺傳多樣性，探討物種的親緣關(guān)系和進(jìn)化趨勢。因此它是藥用植物資源保護(hù)和種質(zhì)資源保存的依據(jù)，特別是對瀕危物種的研究更具有實(shí)際意義。

②標(biāo)記可用于生藥分類，在DNA分子水平上鑒別生物不同種、亞種、變種甚至株。

③標(biāo)記可用來制作生物類生藥系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上的樹狀圖，特別是種內(nèi)水平。這為生藥親緣進(jìn)化關(guān)系,尋找新的藥用資源開辟了新途徑。

④標(biāo)記可用于構(gòu)建基因圖譜，進(jìn)行基因定位，和對未知序列的DNApian段擴(kuò)增與測序。

⑤標(biāo)記亦可用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，指導(dǎo)藥用植物育種，防止品種間雜化和自交，選育優(yōu)良性狀的品